Absolutely RNA FFPE Kit [RUO]

用途

• パラフィン包埋組織からのLaser Microdissection サンプル
• Retrospective な遺伝子発現解析 　
• 遺伝子発現の相対定量解析（新鮮な腫瘍 vs 古い腫瘍）
• 古い組織と腫瘍サンプルの分子生物学的解析

アジレント(旧ストラタジーン)のAbsolutely RNA FFPEキットは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）されたサンプルから簡単に、しかも毒劇物を使わずにRNAを精製できます。さらに、ホルマリン固定のプロセスで生じるRNA分子に対する化学的な構造変化を最適に修復することにより、PCR可能なRNAを大量に回収することができます。本製品にはアジレント(旧ストラタジーン) QPCR Human Universal Reference RNA standard が含まれており、定量PCR実験の反応条件の評価や、実験間の比較を容易に行うことができます。特にFFPE組織を用いた実験では効率が大きく変動するため、このTotal RNAをコントロールとすることで、定量逆転写PCR(QRT-PCR)の有意義なデータを得ることができます。本製品には、脱パラフィンから精製RNAの溶出まで必要なすべての試薬が包装されており、別途試薬を購入する必要はありません。

パラフィン包埋組織からの確実なRNAの回収

ホルマリン固定パラフィン包埋組織はｍRNA発現解析、DNAマイクロアレイ、QRT-PCRなどの分子遺伝学的解析に幅広く使用されています（１－１４）。しかしながら、ホルマリン固定パラフィン包埋後に時間がたったサンプルからQRT-PCR解析に十分な量のRNAを単離することは困難です。また、サンプルの固定のプロセスでRNA分子が変性し、以降の実験への使用ができない場合もあります。Absolutely RNA FFPEキットではこれらの変性を修復し、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からのRNA精製の確実性を向上させていますので、特に laser microdissection (LMD)によって得られたサンプルに適しています。また、本キットは競合他社のキットと比較し、QRT-PCR解析により適したRNAを回収することができます（表１）。

表１：QRT-PCRに適したRNAの回収＝より高感度　Absolutely RNA FFPEキットで精製されたRNAはQRT-PCR解析可能なRNAをA社のキットと比較して多く回収することができますので、より高感度での解析が可能になります。Absolutely RNA FFPEキットおよびA社のキットにより得た100 ngのRNAに対して、２つの遺伝子でプローブを用いた1-step QRT-PCR（Brilliant QRT-PCR Master Mix, 1-Stepを使用）を行いました。その結果、Absolutely RNA FFPEキットで得たRNAでは、いずれの組織由来のRNAのいずれのターゲット遺伝子においても、より低いCt 値が得られました。

DNA-フリーのRNA

Absolutely RNA FFPEキットにより高純度のDNA-フリーRNAを抽出することが可能です。本キットは脱パラフィン処理とプロテイナーゼK消化後、ゲノムDNA除去のためのカラム上でのDNase処理を含む3段階で純粋なRNAを精製します。RNAの純度を検定するために、３つの組織（肝臓、結腸、腎臓）由来のサンプルのA260/A280比率を計測しました。その結果、いずれのサンプルでもA260/A280 比率は1.8以上で、RNA純度が高いことが示されました（表２）。さらに、A社のキットと比較し、アジレント(旧ストラタジーン)のAbsolutely RNA FFPEキットは3時間という短いプロテイナーゼK消化で、より多くのRNAを回収することができました（図１）。

Absolutely RNA FFPEキットの概要

Absolutely RNA FFPEキットはシンプルで確実、フェノール-フリーのプロトコールでパラフィン包理組切片からRNAを精製します。まず最初に組織断片をd-limoneneで脱パラフィン処理した後、エタノール‐ベースの溶液で洗浄します。次に切片をプロテイナーゼK消化して固定組織を可溶化し、核酸を溶液中に遊離させます。最後にRNAをAbsolutely RNAキットにより精製します。RNA精製のプロトコールでは、まずサンプルを強いタンパク変性剤（カオトロピック グアニジンチオシアン酸塩） を含むRNA Binding バッファーに懸濁し、RNaseによるRNA分解を阻害します。次に細胞残屑を除去するためにサンプルをマイクロ スピン カップで濾過し、さらにシリカ‐ベースのファイバーマトリックス スピン カップにアプライします。サンプル内の核酸はファイバーマトリックスに結合し、DNAはカラム上でのDNase I 処理により除去されます。固定されたRNAは不純物を除去するために洗浄され、トータルRNAは最終的に30 ulの容量で溶出されます。精製されたRNAはQRT-PCRによる遺伝子発現解析にご使用いただけます。

実験間の比較が容易

パラフィン包理組織では、厚みが同じ10ミクロンの切片であっても、組織の採取方法、組織の状態、固定方法、保存期間、保存状態等の違いにより、組織ブロック間で大きな個体差が生じることがあり、下流の解析において大きな差として現れる可能性もあります。この差を最小限にするために、アジレント(旧ストラタジーン)のAbsolutely RNA FFPEキットにはアジレント(旧ストラタジーン) QPCR Human Universal Reference RNA standard が含まれておりますので、QPCRの際にサンプル間のターゲット遺伝子の発現量を標準化するためにお使いいただけます。また、QPCR Human Universal Reference RNA を用いてQPCRの条件を最適化することで、貴重なパラフィン包理組織由来のRNAを無駄なく使用することができます。

ORDERING INFORMATION

Product	Catalog #	Amount	Price
Absolutely RNA FFPE Kit, 50 preps 400809 50 preps お問い合わせください Call シンプル、確実、フェノール-フリーのプロトコールでパラフィン包理組切片から高純度のRNAを単離。アジレント QPCR Human Universal Reference RNA standard が含まれており、意義のある定量RT-PCR（QRT-PCR)のデータを測定可能。 Deparaffinisation reagents, Proteinase K, Pre-filter spin cups, RNA binding spin cups, ß-mercaptoethanol, lyophilized DNase, DNase buffers, Wash buffers and Elution buffer, アジレント QPCR Reference Total RNA (Human). 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル
Absolutely RNA FFPE Kit (w/o deparaffinization reagents), 50 preps 400811 50 preps お問い合わせください Call シンプル、確実、フェノール-フリーのプロトコールでパラフィン包理組切片から高純度のRNAを単離。アジレント QPCR Human Universal Reference RNA standard が含まれており、意義のある定量RT-PCR（QRT-PCR)のデータを測定可能。 Proteinase K, Pre-filter spin cups, RNA binding spin cups, ß-mercaptoethanol, lyophilized DNase, DNase buffers, Wash buffers and Elution buffer, アジレント QPCR Reference Total RNA (Human). 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル