GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit [RUO]

用途

• タンパク質の構造-活性相関の分析
• タンパク質の分子進化(Directed Evolution)
• プロモーター・エンハンサーエレメントの解析

GeneMorph II EZClone domain Mutagenesis キットは簡単、迅速かつ柔軟性のあるクローニング法で、目的のタンパク質ドメインにランダムな変異導入を行うことができます。このキットに含まれるMutazyme II DNA ポリメラーゼは、均一な突然変異スペクトルの導入が可能で、AとTにおける突然変異がGとCの変異と同頻度で導入されます。これによって、すべての種類のランダム突然変異を偏りなく導入することができ、タンパク質の構造と機能の関係に関与している重要なアミノ酸の探索が容易に行えます。また、Mutazyme II DNAポリメラーゼでは収量が向上しているため、クローニングやライブラリー構築がこれまでになく簡単にできるようになりました。

Error-Prone PCRでランダム突然変異導入を容易に

Error-prone PCRは、アミノ酸の変化をタンパク質に導入するためのランダムな突然変異導入法の1つです。Error-prone DNA ポリメラーゼと反応条件の最適化により、PCRによる増幅中に突然変異が意図的に導入されます。ランダムな突然変異を含むDNA配列を発現ベクターにクローニングし、変異体のライブラリーをスクリーニングしてタンパク質活性変化の解析がおこなわれます。Error-prone PCR法は一般的には Taq DNAポリメラーゼを用いますが、これはこの酵素に校正機能がなく、本来の性質としてerror-prone であるためです。¹ 突然変異が有用な頻度で起こるようにするためには、Mn²⁺を添加したり、dNTP濃度を不均衡にすることでTaq DNAポリメラーゼのエラー発生率を増加させます^2,3 が、このような条件変更によって、PCR産物の収量が低下したり⁴ 得られた突然変異のスペクトルに強い偏り(たとえばA とT に偏るなど)が生じる可能性もあります。³

均一な突然変異スペクトルを実現

Taq ポリメラーゼは error-prone 条件下ではG/CよりもA/Tに突然変異を生じる可能性が4倍高くなっています。このような突然変異の偏り（バイアス）により、得られるライブラリーが縮小されてしまいます。Mutazyme II DNAポリメラーゼ†は突然変異の偏りを最小限に抑えながらも有用な突然変異導入率が得られるよう新たに開発された酵素です 。従って、Mutazyme  IIにより作製したライブラリーなら、ほかの酵素を用いて作製した場合と比較して、表現型の種類がさらに向上した質のよいライブラリーになることが期待されます。

革新的なクローニング法によりライブラリー構築を簡単に

変異を導入したいドメインはまず、Mutazyme II DNA ポリメラーゼ†を使った error-prone PCRで増幅することでランダムな突然変異を導入します。PCR産物を精製し、EZClone 反応に加えるとPCR産物はメガプライマーとして働きます。メガ プライマーは鋳型のプラスミドにアニーリングし、正確性の高いDNAポリメラーゼにより伸長が行われます。この反応の産物を、鋳型プラスミドを除去するためにDpnI処理をした後に、コンピテントセルへのトランスフォーメーションに用います。得られたランダム突然変異ライブラリーではファンクショナルスクリーニングなどを行うことができます。全工程が数時間の反応と一晩のトランスフォーメーションで終了するので、ランダム突然変異ライブラリーを迅速、かつ効率的に構築することが可能です。また、制限酵素部位を必要とせずに目的のドメインにランダムな変異を導入することができます。

突然変異導入頻度のコントロールが容易

GeneMorph II キットでは、同じ最適反応条件(一定濃度のMgCl²、バランスのとれたdNTP)で突然変異導入頻度を低、中、高と変えることができます。変更するパラメータはテンプレートDNA濃度だけで、均一の突然変異スペクトルを維持したまま幅広い範囲の突然変異頻度(PCR 1回につき0.1 から1.6%)を実現可能です。

用途に合わせて変異導入頻度を調節

GeneMorph II キットを使えば、目的に合わせて最適な突然変異導入頻度を選ぶことができます。構造-機能相関解析には、一般的に遺伝子1個あたりアミノ酸1個の変化（ヌクレオチドは1～2個）が望ましいとされています。タンパク質の分子進化(Directed evolution)研究では、遺伝子1個あたりアミノ酸1～4個の変化(ヌクレオチドでは2～7個の変化)が一般的には用いられています。^5‐8 遺伝子1個あたり20箇所という高い突然変異頻度のライブラリーから活性の上昇したタンパク質が単離された例もあります。。⁹

必要なものが全て含まれた完全なキット

GeneMorph II Random Mutagenesis キットには、Mutazyme II DNA ポリメラーゼ、反応バッファー、dNTPおよびゲル・スタンダードと、PCRによるランダム突然変異導入に必要なものが全て含まれています。

参照

 1.) Cline, J., et al (1996) Nucleic Acids Res. 24:3546-3551. 2.) Leung, D.W., et al (1989) Technique 1:11-15. 3.) Cadwell, R.C. and Joyce, G.F. (1992) PCR MethodsAppl. 2:28-33. 4.) Vartanian, J.P., et al (1996) Nucleic Acids Res.24:2627-2631. 5.) Shafikhani, S., et al (1997) Biotechniques 23:304-310. 6.) Wan, L., et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.95:12825-12831 7.) You, L. and Arnold, F.H. (1996) Protein Eng. 9:77-83. 8.) Cherry, J.R. et al (1999) Nat. Biotechnol. 17:379-384. 9.) Daugherty, P.S., et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 97:2029-2034.

ORDERING INFORMATION

Product	Catalog #	Amount	Price
GeneMorph II Random Mutagenesis Kit 200550 30 rxns お問い合わせください Call The GeneMorph II random mutagenesis kit takes error-prone PCR to the next level by combining mutational spectrums of both our Mutazyme DNA polymerase and Taq DNA polymerase. Mutazyme II DNA polymerase 10X Mutazyme reaction buffer 40 mM dNTP mix 1.1 kb gel standard 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル
GeneMorph II EZClone Domain Mutagenesis Kit 200552 10 rxns お問い合わせください Call This kit features an easy, fast and flexible cloning method so that targeted random mutagenesis can be performed on protein sub-domains and promoter elements. Mutazyme II DNA polymerase, 10X Mutazyme II reaction buffer, 40 mM dNTP mix, 1.1 kb gel standard, GeneMorph EZClone Enzyme mix, GeneMorph EZClone restriction enzyme, GeneMorph EZClone Solution, XL10 Gold Ultra Comp cells, XL10 Gold BME mix, Positive control plasmid, Positive control primers 分析保証書 (C of A)　　 マニュアル