蛍光はフォトルミネセンスプロセスです。フォトルミネセンスは、物質が特定の波長の光を吸収し、その後、より長い波長（通常は可視光または近可視光）で光を再放射する現象です。この放射光は、フォトルミネセンス放射として知られています。
発光
発光現象を理解すると、蛍光やリン光を説明しやすくなります。発光とは、放射システムがエネルギーの高い状態から低い状態へ変化する間に光を放出することです。物体は励起して、エネルギーの高い状態を作り出すことができます。励起するには、電流を流したり（エレクトロルミネセンス）、放射線を照射したり（放射線ルミネセンス）、光源を物体に照射したり（フォトルミネセンス）します。フォトルミネセンスは分光分析ラボで最も一般的に行われている方法です。光の放出が化学反応の結果（化学発光）や生化学反応の結果（生物発光）であることもあります。
発光という言葉があてはまらない現象もあります。加熱による光の放出（白熱）は発光プロセスではなく、熱発光（加熱の際の光の再放出）プロセスと完全に区別する必要があります。
フォトルミネセンス、放射、吸光
電磁放射線を化合物に照射すると、その放射線の一部が吸収されます。照射されたエネルギーに応じて、この吸収がさまざまなプロセスを引き起こします。
これらのプロセスすべてにおいて、吸収された光は、より高いエネルギー状態に到達するためにシステムが必要とするエネルギーを当然持っています。化合物が異なれば、エネルギー状態の間の「ギャップ」も異なり、これが独自の発光スペクトルや吸光スペクトルを生み出します（図 1）。吸光分光分析は、このようなエネルギー状態のプロファイルを測定し、電子励起状態に関する情報を提供します。
図 1.フォトルミネセンスの際、分子で発生するプロセス
「励起された」化合物は、例えば、溶媒の分子との衝突により、分子の周囲にエネルギーを放出することができます。
光の放出は外部からのきっかけがなくても起こります（自然放出）が、（レーザーなどで）起こる誘導放出とは大きく異なります。放出される光（蛍光）のエネルギーは、通常、吸収された光のエネルギーよりも小さくなります。結果として、吸光帯と発光帯が鏡像関係になることがよくあります（図 1）。最も低いエネルギー吸収帯の最大値と最も高いエネルギー発光帯の最大値のエネルギーの差は「ストークスシフト」と呼ばれます（図 2）。
図 2ストークスシフトという用語は吸光と発光のエネルギー差を表します。
蛍光分光分析では、サンプル化合物が吸収できるエネルギーを持った単色光（通常、紫外線または可視光線）をサンプルに照射します。サンプルはこの励起光子を吸収して、分子を基底状態から励起電子状態へ励起します。その後、分子は基底状態へ戻り、結果として生じたエネルギーが光子として放出され、これが分子の蛍光を引き起こします。これらの光子の強度と周波数が検出、分析され、この情報を使って分子の振動エネルギー準位の構造が決定されます（図 1 を参照）。これにより、その分子が何であるか、どのくらい存在するか、何らかの変化をするのか、同じサンプル内の別の分子とどのように相互作用するのかなど、さまざまなことがわかります。結果として得られるアプリケーションは広範囲に及びますが、それについては後述の FAQ で説明します。
蛍光分光分析という用語は主にサンプルの蛍光の分析に関係していますが、この説明の大半はリン光にもあてはまります。
蛍光分光分析とサンプル濃度
蛍光分光分析の最も重要な用途の 1 つに未知のサンプルの濃度測定があります。この測定を行うには、サンプルの濃度とその蛍光シグナル強度の関係を知る必要があります。では、サンプルの蛍光強度は何で決まるのでしょうか。
蛍光シグナルが、励起化合物の数（図 3）と、励起状態の分子が光を放出し始める可能性を表す定数に依存することは道理にかなっています。
F ≈ Φ •（励起状態の分子の数）
図 3. 蛍光強度はサンプル中にある励起状態の分子の数に比例
この定数 (Φ ) は蛍光量子収率と呼ばれ、放出された光子と化合物に吸収された光子の比率を表します。化合物の量子収率が大きければ大きいほど、蛍光性が高くなります。
励起状態に到達する分子の数は、光源強度に大きく依存します。サンプルにあたる光が多ければ多いほど、吸収される光も増えます。しかし、これはサンプル化合物がどのくらい光を吸収できるかにも左右されます。特定のエネルギーの光を吸収するこの能力は、化合物の吸光係数 (ε)で表され、吸光分光分析の基礎となります。
つまり、励起状態に到達する分子の数は、サンプルに到達した光(I0) とサンプルを通り抜けた光 (I)の強度差で表すことができます。
（励起状態に達した分子の数） = I0 – I
ランベルト・ベールの法則 (I = I0 • 10-εlc)を使用すると、サンプル後の強度は次のように書き換えられます。
（励起状態にある分子の数） = I0 – I0 • 10-εlc = I0 • (1-10-εlc)
最終的には次のようになります。
F = Φ • I0 • (1-10-εlc)
つまり、ランベルト・ベールの法則は、蛍光シグナル強度とサンプルの濃度を関連付けます。しかし、この関係が直線的なのは、希釈されたサンプルについてのみです（図 4）。光学密度（OD）が 0.05 を下回る場合、蛍光シグナルは濃度に対して直線的なままになります（蛍光に関するあらゆる「ベストプラクティス」本に OD は 0.05 と記載されています）。
シグナルと濃度の非直線関係を用いて、蛍光強度から未知のサンプルの濃度を判断することもできます。しかし、このような場合、問題に対する十分な注意と意識を持って、検量線を作成する必要があります。
図 4. サンプルの濃度と光学密度（OD）によっては、蛍光強度は直線になりません。蛍光強度は濃度（青）に対して指数関数的に増加し、線形曲線（赤）から乖離します。希釈されたサンプル（OD < 約 0.05）の場合、かなり正確な概算で、濃度と蛍光強度の関係は直線になります。線形曲線（赤）と「本当の」指数曲線（青）は基本的に 0.05 OD まで同一です。
蛍光分光分析の主要原理については、この FAQ 全体を通して詳しく説明されていますが、要約すると次のようになります。
蛍光分光分析にはさまざまな種類があり、それぞれ、蛍光分子とその相互作用の異なる側面を調査できるように設計されています。主な種類には以下のようなものがあります。
蛍光分光分析は、学術研究や実社会で使用される有益な手法です。蛍光分光分析は、分子の電子状態（エネルギー、極性など）、光を吸収した後に起こるプロセス（エネルギー移動、緩和、項間交差など）とその期間に関する詳しい情報を提供します。この情報は、学術的な興味を引くものであるだけでなく、LED や太陽電池などのオプトエレクトロニクスデバイスの材料を選ぶときにも重要です。蛍光分光分析は、指定された分子の分光学的特性調査に用いられるだけでなく、分析ツールとしても使われます。詳細については、 蛍光分光分析アプリケーションガイドをご覧ください。
蛍光分光分析の用途は、化学と材料（アカデミアを含む）、およびライフサイエンスの大きく 2 つに分けられます。2 つめのライフサイエンスでは、近年、特に細胞分析などで、蛍光分析機器の使用が急激に増加しています。
分子の中には自然に蛍光を発するものがあります。また、ある条件のもと、特定の方法で蛍光するものや、非常に特殊な用途のために合成されたものもあります。蛍光物質には次のようなものがあります。
化学および材料における用途
蛍光分光分析は、蛍光反応物や蛍光産物が関与する反応をモニタリングするための手法として使用されます。この手法には、柔軟なサンプリングができる（例えば、反応フラスコ内で光ファイバプローブを使用した直接測定が可能）や、スキャン速度が極めて高速で、短寿命種を分析できるなどの利点があります。蛍光物質を活用したより具体的な用途には次のようなものがあります。
ライフサイエンスにおける用途
ライフサイエンスの分野では、蛍光分光法の多用途性と、カイネティクス測定の実施、細胞内イオン濃度の検出、偏光フィルタを用いた分子の回転運動の解析、サンプル温度のきめ細かな制御などの能力が役立っています。用途としては次のようなものがあげられます。
査読済み資料へのリンクを含め、ライフサイエンス分野での用途について、詳しくは Cary Eclipse 蛍光分光光度計アプリケーションガイドをご覧ください。
図 5. Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計の室内光耐性により、光ファイバサンプリングのシームレスな統合が可能です。光ファイバプローブを使って、本体のサンプルコンパートメント外でリモート測定をすることができます。通常は大きすぎて機器に入らないようなサンプルでも、簡単に分析できますし、光ファイバディッププローブがあるので、キュベットは必要ありません。
蛍光、リン光、生物発光、化学発光が関連する測定はすべて、蛍光分光光度計を使って行うことができます。実のところ、このタイプの機器の呼称は数種類あり、蛍光分光計、蛍光光度計なども同じものを表しています。蛍光分光分析という手法自体も、蛍光分光測定法、蛍光光度法などと呼ばれることがよくあります。
蛍光分光光度計は通常、モノクロメータを使用して、特定の励起波長を選択し、放出された蛍光波長を測定します。より簡単な「フィルタ蛍光光度計」システムは、光学フィルタを使って同じことを行いますが、要求された励起波長と発光波長に応じて変更する必要があります。
蛍光分析機器は測定タイプに汎用性があるため、世界中の分析ラボでよく見られます。また、マルチプレートリーダーや光ファイバプローブなどのアクセサリと組み合わせて、さらに柔軟性を高めることも可能です。
図 6. Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計
Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計 は蛍光、リン光、化学発光、生物発光を測定します。アクセサリを使用すれば、光ファイバプローブを介したリモート測定、温度制御、固体サンプルへの対応が可能です。また、マイクロプレートリーダーを追加して、サンプルのスループットをさらに高めることもできます。
蛍光分光光度計では、サンプル化合物が吸収できるエネルギーを持った単色光をサンプルに照射します。サンプルは全空間方向に光を放出します。市販の分光計の大半では、放出された光は励起光に対して直角に検出されます。これは光源自体からのアーチファクト軽減に役立ちます。検出システムは、放出された光の強度を分析し、波長分布を決定します。したがって、最新の蛍光分光光度計は、独立した 2 つのモノクロメータを使用しています。1 つは光源の正確な励起波長を選択するため、もう 1 つは放出された光を分析するために使用されます（図 7）。
図 7. Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計構成の概略図。 放出された光は、励起光に対して直角に検出されます。 最新の蛍光分光光度計は独立した 2 台のモノクロメータを使用し、1 台で励起波長を、もう 1 台で放出された光を分析します。
光源、モノクロメータ、検出器
最新の蛍光分光光度計は、さまざまな光源を使用しています。レーザーは正確な固定波長を提供します。従来の水銀ランプは費用対効果に優れていますが、強度があまり均一ではなく、頻繁に交換する必要があります。Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計 はフラッシュ寿命 30 億回のキセノンフラッシュランプを使用しています（通常、10 年間使用できます）。貴重なサンプルや繊細な生体サンプルは、その少量を使用して、サンプルを光により変性させることなく測定できます。また、室内光耐性があるため、本体のサンプルコンパートメント以外のところで（例えば、光ファイバプローブを使用して）測定を行うことができます。
モノクロメータでは、励起と発光の両方で、光の波長を選択できます。モノクロメータは光束を成分波長に分割する回析格子を使用していて、波長はそれぞれ、異なる角度でモノクロメータから出ていきます。このため、回析格子の正確な動きを利用して、波長を選択することができます。回析格子のコーティングは、全波長範囲にわたり感度が確保されるように最高の設計がなされています。
グレーティングの駆動はランプがオフの時に行われる go-stop-flash 方式を採用しており、測定中に波長がシフトすることはありません。これにより、24,000 nm/min での高速スキャンにおいても、ピークシフトをすることがありません。また、Eclipse のモノクロメータはどちらも、散乱光を最小限に抑え、二次迷光を防ぐためのビルトインフィルタを搭載しています。各モノクロメータに 自動偏光測定フィルタを追加すれば、蛍光偏光（または蛍光異方性）を測定できます。
光電子増倍管（PMT）は弱い光の検出に理想的なので、蛍光分光光度計の検出器として使用されることがよくあります。PMT 検出器では、入射した光子が電子の二次放出を次々と引き起こし、測定可能な強い電流を作り出します。
Cary Eclipse は、長波長域で高い感度を示す光電子増倍管（PMT）検出器を採用し、紫外線（UV）性能を損なわずに、最大 900 nm の優れた感度を実現しています。Eclipse はスペクトルの可視領域で卓越した感度を発揮しますが、多くの 蛍光染料やマーカーがこの領域で発光するため、この特性は重要です。また、Eclipse はトリプトファンやチロシンなどの重要なアミノ酸の測定が行われる UV 領域でも卓越した感度を発揮します。700 nm を超える高感度に対応したオプションの PMT 検出器もご用意しています。
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蛍光測定は大きく 2 つのカテゴリに分けられます。
温度や濃度の変化、溶媒の影響などさまざまな要因により、蛍光分光が変化することはよくあります。発光スペクトルと励起スペクトルを組み合わせて、発光の 3 次元マップを作成することができます。これは、放出された光子の強度を、励起波長と発光波長の両方の観点から描いたものです（図 8）。
図 8. 蛍光励起発光マトリクス（EEM）等高線プロット。
蛍光分光光度計では、次のように、さまざまな種類の測定ができます。
Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計 は使いやすいシステムで、機器コントロールとデータ解析のための Cary WinFLR ソフトウェアが付属しています。自動化されたワークフローは大半のユーザーに最適でありながら、ソフトウェアには熟練ユーザー向けの高度な機能も多数搭載されています。
蛍光分光分析には、次のような大きな利点があり、これにより、蛍光分光計が分光分析ラボのほとんどで、なくてはならない分析ツールとなっています。
図 9. スクリーニングツールとして使用される、マイクロプレートリーダー付き Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計
蛍光分光分析は強力な手法ですが、欠点もあります。
蛍光クエンチングは、蛍光色素分子が他の化合物（同じ種の分子、またはまったく異なる化合物）と相互に作用し、その結果、蛍光が減少するプロセスです。このプロセスは複雑ですが、簡単に言えば、溶液に含まれる分子が多ければ多いほど、クエンチングプロセスが発生しやすくなります。クエンチングプロセスが重要な役割を果たすサンプル濃度に達すると、蛍光強度は濃度の増加とともに減少します。
蛍光の内部フィルタ効果は、サンプルの吸収性が非常に高く、入射光がすべて、キュベットの前面付近で吸収される場合に起こります。光はサンプルのごく一部により完全に吸収され、サンプル全体は適切に蛍光せず、結果として得られる強度はサンプル濃度を正確に表しません。励起光が吸収されたことによる減光は、多くの場合、1 次内部フィルタ効果と呼ばれます。また、より濃縮されたサンプルで、放出された蛍光シグナルが、同じタイプの別の蛍光色素分子にも吸収される 2 次内部フィルタ効果もあります。サンプル内で吸収された蛍光は検出器まで届かないため、この場合も、濃度と強度に非線形な相関性が生じます。
より濃縮されたサンプルでは、内部フィルタ効果を最小限に抑えるため、さまざまな手法が用いられます。サンプルの吸光度がより低くなる励起波長を選択することで、1 次内部フィルタ効果を抑えられます。 Cary Eclipse 蛍光分光光度計では、小容量の三角形キュベットを使用して、光路長を短縮し、サンプルの吸光度を下げることができます。Cary Eclipse の固体サンプルホルダを使えば、キュベットの位置を調節して、キュベットの前面から放射され、分光光度計の光学系に入射する光子の数を最大化できます（「前面」セットアップ）。この場合も、光路長が短縮され、1 次および 2 次内部フィルタ効果が軽減されます。
分子の蛍光寿命（またはリン光寿命）とは、励起から光子放出までの平均時間、つまり、分子の励起状態の平均継続時間です。寿命は、通常、サンプル濃度やクエンチング、内部フィルタ効果の影響を受けないため、蛍光強度と並び、有効な評価パラメータとなります。生体サンプルではよくあることですが、分析対象のサンプルが蛍光性の強いバックグラウンド混合物に含まれている場合でも、蛍光寿命は測定できます。蛍光寿命の測定値は、サンプル混合物に含まれる蛍光種の特性解析に使用可能で、タンパク質の生物物理学的研究において重要な役割を果たします。
リン光は、蛍光と同じく、フォトルミネセンスの一種で、分子が励起電子状態から基底状態へ緩和することにより、光子が放出されます。ただし、蛍光は非常に短時間のプロセス（通常、継続時間は数ナノ秒）ですが、リン光物質は通常、はるかに長時間（数マイクロ秒から数分、数時間のことも）発光を続けることがよくあります。
その理由は、先の FAQ でも説明したとおり、蛍光が「許容」プロセスを使用して発生するのに対し、リン光プロセスはエネルギー状態の「禁制」遷移を使うからです。これは蛍光が起こらないという意味ではありません。ただ、はるかに長い時間がかかるということです。遅延蛍光を示す分子もあります。この場合、発光プロセス（蛍光）は許容プロセスですが、一部のランタノイドに見られるように、発光が遅れます。
リン光マーカーと遅延蛍光マーカーは、生体分子のラベリングによく使われます。リン光測定や遅延蛍光測定を実施するとき、放出された光の検出と励起事象の間には大きな時間差があります。これは、よくあるバックグラウンド蛍光（細胞または媒体の自家蛍光）の問題を排除するための信頼できるメカニズムを提供するため、相当のメリットがあります。バックグラウンド蛍光の問題をそのままにしておくと、前述のような分析が複雑になり、（フルオレセイン、ローダミンなどの）一般的なプローブからの定常状態の発光が干渉され、バックグラウンドシグナルが上昇する大きな要因となります。
Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計では、1 回の測定で、同じサンプルからの直接発光（ナノ秒の時間スケールで発生する蛍光）とリン光発光（ミリ秒の時間スケール）の両方を測ることができます。これにより、生体分子サンプルからの発光と、蛍光ランタノイドマーカーからの発光を一度に調査できます。
Cary Eclipse では、ハードウェアを変更せずに、蛍光、リン光、化学発光、生物発光の測定モードを簡単に切り替えることができます。
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ほとんどの場合、フォトルミネセンスは蛍光プロセスです。「遷移」（高いエネルギー状態から低いエネルギー状態へのジャンプ）が「許容プロセス」である場合、発光は蛍光と呼ばれます。遷移が「禁制プロセス」である場合の発光がリン光です。禁制というのは、起こりえないという意味ではなく、許容プロセスほどは起こらないということです。また、禁制プロセスではより時間がかかります。リン光化合物の寿命が蛍光化合物よりもはるかに長いのはこのためです。
注：化学発光や生物発光、エレクトロルミネセンスは蛍光またはリン光ですが、この区別はほとんど重要ではありません。
化学発光とは、化学反応の結果として起こる光の放出のことです。化学発光は励起状態になるための励起光子の吸収を伴わないため、厳密に言えば、フォトルミネセンスではありません。化学発光では、励起状態は化学反応の産物で、例えば、蓄光スティックのような化学物質の混合により起こります。
Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計では、蛍光、リン光、化学発光、生物発光の測定を簡単に切り替えることができます。
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生物発光は、生命体が生み出す光で、化学発光の一種です。生物発光は生化学反応の結果であり、クラゲやホタルなどの種によく見られます。
Agilent Cary Eclipse 蛍光分光光度計では、蛍光、リン光、化学発光、生物発光の測定を簡単に切り替えることができます。
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