詳細 - SureSelect Target Enrichment システム

アジレントの SureSelect Target Enrichment システムは、次世代シーケンシングのコスト効率とプロセス効率を大幅に向上します。きわめて効率の高いハイブリッド選択技術をベースとする SureSelect Target Enrichment システムは、自動化が可能なほか、スケールアップも容易で、大規模なシーケンシングプロジェクトに対応することができます。これらは、他の市販されている Target Enrichment メソッドとは異なる特長です。必要な gDNA 量は 3 µg 以下なので、貴重なサンプルでも効率よくターゲットを絞って次世代シーケンシングを行うことが可能です。

SureSelect Target Enrichment システムのカスタムデザインは、アジレントのオンラインマイクロアレイ設計ツール eArray を利用して行います。詳細については、アジレントの eArray ページをご覧ください。

図 1 に示すように、SureSelect Target Enrichment システムのワークフローは、溶液中での反応をベースとして、PCR チューブまたはマイクロタイタープレートで実行されます。Illumina Genome Analyzer システムについては、シングルエンドおよびペアエンドシーケンシングに対応しています。Life Technologies SOLiD システムについてはフラグメント法に対応しています。直観的なウェブベースの設計ツールであるアジレントの eArray を使って、カスタマイズした Target Enrichment キットを作成することが可能です。各 Target Enrichment キットに含まれるカスタム SureSelect RNA オリゴヌクレオチド (ベイト) は、ストレプトアビジンで標識された磁気ビーズ上で容易にキャプチャできるようにビチオン化されています。そのほか、キャプチャプロセスに必要なバッファやブロッキング試薬もキットに含まれています。


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図 1. SureSelect Target Enrichment システムのワークフロー

各カスタムキットは独自のベイトセットで構成されるため、キットのバリデーションが関心事となります。この点をテストするために、様々な濃縮デザインのキットを作成し、同じサンプルを用いて並行してテストを実施しました。性能を評価するために、シーケンスリードにおけるターゲット領域にマッピングされるリードの割合を測定しました。この方法なら、濃縮効率をもっとも直接的に測定できます。8 種類のデザインのシーケンスリードがターゲット領域に含まれる割合は約 40 ～ 80 % で、複数のキットデザインを通じて、目的の領域のみに効率よくターゲットを絞れていることが示されました。この割合は 300 ～ 7400 倍の濃縮に相当します。(この数字は、ターゲット領域の大きさやシーケンシング 1 回あたりのリード数により大きく異なります。通常、キャプチャデザインが小さいと、ターゲットゲノムの小さいサブセットにおけるシーケンスリードのフォーカシング効率が高くなるため、濃縮の度合いは大きくなります。)


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図 2. 幅広いカスタムデザインにおける SureSelect Target Enrichment システムの堅牢性

特異的なキャプチャ手法を用いても、DNA サンプルのランダムな断片化によって、ターゲット領域とその近傍の DNA の両方がキャプチャされます。アジレントはデザインアルゴリズムとプロトコルを最適化し、ターゲット近傍の配列のキャプチャを制限できるようにしました。この点を確認するために、ターゲットから 100 bp 以内および 200 bp 以内の領域について、ターゲット上のシーケンスリードを分析し、SureSelect システムの特異性を測定しました。100bp から 200 bp まで領域を拡大したときのシーケンスリードについて、ターゲット以外の領域のキャプチャ率がほとんど上昇していないことが、図 2 からわかります。


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図 3. SureSelect Target Enrichment シーケンスのカバレッジ

DNA シーケンシング研究において、もう 1 つの重要な指標となるのが、リード分布です。リード分布は、シーケンスの変異を特定するためにゲノムを十分にカバーできているかという能力に影響を与えます。この指標を確かめるには、2 つの方法があります。1 つは、実際のリード数について、塩基単位でリード数のパーセント分布をプロットする方法。もう 1 つは、リードの深さと累積数をプロットする方法です。図 3 は、代表的なサンプルのプロットです。この図を見れば、全シーケンスの約 80 % が 20X 以上の読み取り深度であることがわかります。このことは、ターゲットリシーケンシングによる SNP 分析に関して、このメソッドが適していることを示しています。

デザインの堅牢性、特異性、包括的なシーケンスカバレッジを実現する SureSelect Target Enrichment システムは、他の市販 Target Enrichment 製品とは一線を画す優れたシステムです。

掲載の製品は、すべて試験研究用です。診断目的にご使用いただくことはできません。